Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi missense mutation c.300G>T exon 3 gen PIT-1 dengan menggunakan analisis PCR-RFLP. Pelaksanaan penelitian dimulai dari pengambilan sampel darah sapi perah Friesian Holstein (FH) di PT. Ultra Peternakan Bandung Selatan. Ekstraksi DNA, amplifikasi dan genotyping gen PIT-1 dilakukan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) dilaksanakan di Laboratorium Terpadu sub Biologi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Penelitian ini menggunakan sampel darah sebanyak 96 sapi perah Friesian Holstein (FH). Amplifikasi dan genotyping gen PIT-1 menggunakan primer forward 5'- CCT TTT AGA ACT GAG ACT GGC TG-3' dan primer reverse 5'-CCC ACA GCT GTT AAC AAG CA-3' yang menghasilkan produk amplifikasi sebesar 356 pb yang kemudian direstriksi dengan enzim EcoO109I. Terdapat 3 genotype pada sapi Friesian Holstein yaitu TT, TG dan GG. Homozigot TT mempunyai 1 pita DNA yaitu 356 pb, genotype TG mempunyai 3 pita DNA dengan panjang 356 pb, 192 pb, dan 164 pb sedangkan genotype GG mempunyai 2 pita DNA dengan panjang 192 pb dan 164 pb. Frekuensi genotype TT, TG dan GG masing-masing 0,12; 0,63 dan 0,25. Analisis Hardy-Weinberg menggunakan chi- square menunjukkan P<0>missense mutation c.300G>T dari gen PIT-1 exon 3 pada sapi FH bersifat polimorfik. Studi selanjutnya dapat dilakukan untuk mengevaluasi asosiasi c.300G>T dengan sifat kuantitatif.