L-asparaginase merupakan enzim katalis pada hidrolisis L-asparagin menjadi L- aspartat dan ammonia. L-asparagin merupakan asam amino non-esensial yang digunakan untuk sintesis protein dan pertumbuhan dalam sel. L-Asparagin memiliki potensi dalam pengobatan kanker leukimia limfobastik akut dan kanker ganas lainnya. L-Asparaginase dapat dihasilkan dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme seperti fungi, yeast, dan bakteri. Bakteri merupakan sumber L-asparaginase yang paling efektif karena bakteri lebih mudah dikulturkan, mudah dalam  proses ekstraksi dan pemurnian. Mikroba endofit memiliki kemampuan untuk menghasilkan senyawa atau metabolit yang mirip dengan senyawa bioaktif pada tanaman inang karena adanya hubungan simbiosis yang erat dengan tanaman inang. Bakteri membutuhkan substrat berupa asparagin sebagai sumber utama untuk dipecah menjadi L-aspartat dan ammonia. Salah satu tanaman yang mengandung asparagin dan sebagai sumber mikroorganisme adalah mangrove Rhizophora mucronata. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan spesies isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan L-Asparaginase dan mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam menghasilkan L-Asparaginase pada kondisi optimalnya. Sampel yang digunakan adalah bagian akar, batang, dan daun R. mucronata yang sudah disterilisasi bagian permukaan sehingga isolat bakteri yang didapatkan merupakan bakteri endofit yang berasal dari dalam jaringan tanaman. Penelitian ini dilakukan dalam 2 tahap. Tahap pertama dilakukan isolasi, karakterisasi morfologi, dan identifikasi molekuler dengan pencocokan similaritas sekuens DNA dengan data genbank NCBI. Tahap kedua dilakukan screening aktivitas enzim, pengukuran aktivitas enzim dengan metode Nesslerization, dan optimasi aktivitas enzim dari isolat bakteri yang didapat. Isolat bakteri yang didapat pada penelitian ini adalah 54 isolat bakteri; 52 isolat bakteri mampu menghasilkan L-Asparaginase. Kemampuan dan kondisi optimal isolat bakteri endofit dalam menghasilkan enzim berbeda-beda. Semakin tinggi konsentrasi glukosa dapat meningkatkan kemampuan aktivitas isolat bakteri dalam menghasil L-Asparaginase. 3 isolat bakteri teridentifikasi sebagai isolat bakteri Enterobacter hormaechei dengan tingkat similaritas 100%, Bacillus tequilensis dengan tingkat similaritas 99,90%, dan Bacillus subtilis dengan tingkat similaritas 99,46%.