Fasciolosis merupakan penyakit parasit yang disebakan oleh infestasi Fasciola sp. Fasciolosis tetap menjadi perhatian bagi kesehatan masyarakat veteriner karena risiko zoonosis dan cara penularannya. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan prevalensi dan faktor risiko yang berasosiasi dengan infestasi Fasciola sp. pada sapi di Rumah Potong Hewan (RPH) Ampel, Kabupaten Boyolali. Pengamatan dilakukan terhadap 585 ekor sapi selama bulan Februari sampai Agustus tahun 2022. Pemeriksaan postmortem dilakukan untuk mengetahui infeksi fasciolosis berdasarkan patologi markoskopis dan keberadaan cacing dewasa di parenkim hati dan duktuli biliveri. Prevalensi fasciolosis di RPH Ampel mencapai 25,12% (147/585). Faktor risiko dengan nilai odds ratio (OR) tertinggi diamati pada faktor risiko bangsa Ongole (OR=2,39), sapi betina (OR=5,05), body condition score (BCS) 2 (OR=3,30), sapi berumur>3,5 tahun (OR=4,49), dan sapi yang berasal dari luar Kabupaten Boyolali (OR=1,94). Penelitian ini menunjukkan tingginya prevalensi fasciolosis di RPH Ampel yang berkorelasi dengan faktor risiko bangsa, jenis kelamin, BCS, asal, dan umur. Perubahan patologi secara makroskopis dan histopatologi terjadi pada hati yang terinfeksi fasciolosis. Identifikasi molekuler menggunakan Duplex PCR membuktikan bahwa populasi yang menginfeksi hanya F. gigantica. Kerugian ekonomi dari 13 sampel hati yang diafkir akibat fasciolosis sebesar 81.654 gram dengan nilai pasar lokal mencapai Rp. 3.266.160,00. Studi epidemiologi lebih lanjut diperlukan mengingat tingginya prevalensi dan besarnya kerugian ekonomi akibat fasciolosis.