Gen Pituitary Transcription Factor-1(PIT-1) merupakan salah satu gen yang bertanggung jawab terhadap kualitas dan kemampuan produksi susu sapi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui asosiasi polimorfisme gen PIT-1 ekson 6 terhadap kualitas kimia susu yang diamati, terdiri dari laktosa, bahan kering tanpa lemak dan protein pada susu sapi Friesian Holstein (FH) di Indonesia. Sebanyak 96 sampel DNA sapi FH yang diambil dari PT. Ultra Peternakan Bandung Selatan (UPBS) diekstraksi. Hasil amplifikasi gen PIT-1 menghasilkan produk PCR dengan panjang fragmen 451 bp. Produk PCR didigesti menggunakan enzim restriksi HinfI. Identifikasi genotipe menggunakan metode PCR-RFLP. Asosiasi SNP c.828G>A gen PIT-1 dengan kualitas kimia susu sapi FH dianalisis menggunakan analisis variansi (ANOVA) dan uji lanjut Tukey HSD untuk membandingkan rata-rata antar genotipe. Didapatkan frekuensi genotipe yang diamati berturut-turut adalah 0,2 (TT); 0,38 (TG) dan 0,42 (GG), serta frekuensi alel 0,39 (T) and 0,61 (G). Hasil penelitian menunjukkan perbedaan tidak signifikan antara SNP c.828G>A gen PIT-1 dengan kualitas kimia susu pada populasi yang diamati. Penelitian dengan menggunakan jumlah sampel yang lebih banyak dapat dilakukan untuk mengevaluasi asosiasi gen PIT-1 ekson 6 dengan sifat kuantitatif bernilai ekonomi pada sapi FH.