Faktor genetik merupakan faktor yang diwariskan secara individual dan acak, sehingga menyebabkan perbedaan susunan gen dan performa produksi setiap ekor ternak sapi perah Friesian Holstein (FH). Penerapan ilmu bioteknologi terkini memungkinkan ilmuwan untuk menemukan polimorfisme genetik dan menggunakannya sebagai gen kandidat seleksi dalam Marker-Assisted Selection (MAS). Salah satu gen yang dapat dijadikan kandidat seleksi adalah gen Pituitary Transcription Factor-1 (PIT-1) karena perannya dalam mengontrol transkripsi sel penghasil hormon yang berfungsi mengatur produksi dan komposisi susu. Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengevaluasi asosiasi keragaman gen PIT-1 pada sapi FH terhadap kualitas fisikokimia susu dengan metode PCR-RFLP. Genom DNA yang telah diekstraksi dari 95 sampel darah sapi perah FH digunakan dalam penelitian ini. Gen PIT-1 berhasil diamplifikasi dengan teknik PCR menghasilkan fragmen DNA sepanjang 165 pb dan titik mutasi c. 195G>A berhasil diidentifikasi oleh enzim restriksi TaqI. Analisis variansi (ANOVA) dilakukan untuk menganalisis asosiasi keragaman gen PIT-1 dengan kualitas fisikokimia susu dan uji Tukey HSD dilakukan untuk membandingkan rata-rata antar genotipe. Tiga genotipe gen PIT-1 yang ditemukan dalam penelitian ini antara lain: AA (165 pb), AG (165 dan 138 pb), dan GG (138 dan 27 pb). Frekuensi ketiga genotipe secara berurutan adalah 0,05; 0,46 dan 0,48. Analisis asosiasi titik mutasi c. 195G>A dengan nilai pH pada genotipe GG menunjukkan hasil yang sangat signifikan (P-Value=0,001). Kesimpulan penelitian ini adalah terdapat asosiasi antara keragaman gen PIT-1 dengan nilai pH susu, sehingga gen ini dapat dijadikan gen penanda dalam seleksi sapi perah FH di Indonesia.