Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa perbandingan kualitas spermatozoa sapi bangsa Simmental dan Limousin pasca thawing pada umur yang berbeda (3, 5, dan 7 tahun) meliputi motilitas, viabilitas hidup mati, abnormalitas, dan HOS test. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Mei 2023. Tahap penelitian thawing semen beku, motilitas spermatozoa, pembuatan preparat ulas, serta perlakuan Hypo-Osmotic Swelling Test (HOS Test) dilakukan di Laboratorium Produksi Ternak, Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Perlakuan yang diterapkan yaitu berdasarkan umur, bangsa, serta interaksi bangsa dan umur. Larutan eosin-nigrosin digunakan dalam pembuatan preparat ulas serta larutan HOS untuk perlakuan HOS test. Sampel sapi berasal dari 3 individu yang berbeda pada setiap bangsa dan umur sebagai ulangan kemudian dianalisis menggunakan Uji Anova pola faktorial untuk melihat tingkat signifikasi dalam tiap perlakuan yang ditandai dengan nilai probabilitas lebih kecil dari 0,05 (P<0>0,05). Sedangkan bangsa memiliki pengaruh pada parameter viabilitas, abnormalitas, dan HOS test dengan nilai yang signifikan masing-masing yaitu 0,046; 8,43×10-5; dan 4,95×10-6. Interaksi bangsa dan umur terlihat perbedaan yang nyata pada parameter HOS test dengan nilai signifikannya yaitu 0,013. Perlakuan umur menunjukkan kualitas yang berbeda pada keempat parameter. Bangsa juga memiliki kualitas yang berbeda ditinjau dari parameter abnormalitas, viabilitas, dan HOS test. Interaksi bangsa dan umur menunjukkan kualitas yang berbeda hanya pada parameter HOS Test.