Kitosan adalah senyawa yang diperoleh dari ekstraksi krustasea laut. Kitosan memiliki peranan penting dalam bidang pertanian, salah satunya sebagai pemacu pertumbuhan tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perbedaan waktu dan varietas aplikasi kitosan terhadap pertumbuhan bibit rambutan. Penelitian dilaksanakan di Screen House Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta pada bulan Maret-Juni 2022. Metode yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah varietas (varietas aceh, binjai dan rapiah). Faktor kedua adalah waktu aplikasi kitosan (tanpa, pagi, siang serta pagi dan siang). Aplikasi kitosan dilakukan setiap minggu dengan konsentrasi 2 ml/L. Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan ANOVA (Analysis of Variance). Apabila perlakuan berpengaruh nyata terhadap variabel yang diukur, maka analisis data dilanjutkan dengan perbandingan rerata perlakuan menggunakan Duncan's Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5% Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu aplikasi kitosan pada pagi hari menghasilkan tinggi tanaman tertinggi pada semua varietas rambutan. Varietas Rapiah memberikan hasil terbaik pada tinggi tanaman dan panjang akar, varietas binjai memberikan hasil tertinggi pada diameter batang dan luas daun, sedangkan varietas aceh memberikan hasil tertinggi pada jumlah daun.