Resveratrol memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi, akan tetapi kadar obat dalam darah yang kecil yang disebabkan oleh rendahnya bioavailabilitasnya. Pengukuran kadar resveratrol memerlukan metode analisis yang memiliki selektivitas dan sensitivitas yang tinggi salah satunya high performance liquid chromatography (HPLC). Pengujian HPLC memerlukan penyesuaian beberapa faktor seperti laju alir dan komposisi fase gerak, sehingga memerlukan optimasi kondisi analisis yang paling optimum. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh laju alir dan komposisi fase gerak terhadap kromatogram dan menentukan kondisi optimum bioanalisis resveratrol dengan metode central composite design. Analisis resveratrol menggunakan HPLC dilakukan dengan metode elusi gradien. Larutan standar dan sampel plasma yang telah diadisi dengan resveratrol dianalisis dengan variabel laju alir, kecepatan perubahan fase gerak, dan perbandingan pelarut organik dalam fase gerak. Parameter uji kesesuaian sistem yang diperoleh dari kromatogram meliputi waktu retensi, luas puncak, tailing factor, resolusi, dan jumlah plat teoritis dianalisis menggunakan teknik central composite design untuk mengkaji pengaruh masing-masing faktor dan menentukan kondisi optimum. Laju alir, kecepatan perubahan fase gerak, dan perbandingan pelarut organik dalam fase gerak memberikan pengaruh terhadap hasil uji kesesuaian sistem. Hasil penelitian menunjukkan bahwa resolusi dan luas puncak tidak dipengaruhi oleh perubahan komponen fase gerak dan laju alir, sedangkan tailing factor, number of theoretical plates, persentase area, dan waktu retensi dipengaruhi oleh laju alir dan perubahan komponen fase gerak. Kondisi optimum analisis resveratrol dalam plasma diperoleh pada 0,925 mL/menit, kecepatan perubahan fase gerak 4 %/menit, dan perbandingan pelarut organik dalam fase gerak 5%.