Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa L.) termasuk dalam famili Rubiaceae. Tanaman ini belum banyak dimanfaatkan oleh masyarakat. Rumput mutiara mengandung senyawa metabolit sekunder di antaranya golongan iridoid glikosida, steroid, dan triterpenoid. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengisolasi, mengidentifikasi, dan melakukan uji aktivitas antioksidan terhadap senyawa metabolit sekunder dari ekstrak rumput mutiara. Isolasi dilakukan melalui tahap ekstraksi (maserasi) menggunakan pelarut aseton, sedangkan fraksinasi dan pemurnian dilakukan dengan metode kromatografi. Ekstrak aseton difraksinasi dengan kromatografi vakum cair (KVC) menggunakan eluen n-heksan: etil asetat diperoleh 13 fraksi. Fraksi 7 dimurnikan dengan kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis (KLT) dan rekristalisasi. Identifikasi senyawa dilakukan dengan FTIR, 1H NMR, dan 13C NMR, serta dibandingkan dengan data literatur. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Isolat yang diperoleh berbentuk padatan putih merupakan campuran senyawa golongan steroid yaitu ?-sitosterol dan stigmasterol. Ekstrak aseton rumput mutiara memiliki sifat antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 40,38 ?g/mL sedangkan campuran senyawa steroid tersebut tidak aktif antioksidan (IC50 = 442,08 ?g/mL).