Tingginya permintaan bahan bakar menyebabkan berkurangnya sumber energi tak terbarukan. Substitusi bahan bakar, salah satunya bioetanol, diperlukan sebagai alternatif bensin. Bioetanol generasi kedua menggunakan biomassa kaya lignoselulosa. Tandan Kosong Kelapa Sawit (TKKS) merupakan biomassa melimpah di Indonesia berpotensi untuk dijadikan bahan baku bioetanol. Penelitian ini menganalisis pretreatment dengan jamur yang paling efektif terhadap degradasi lignin dan selulosa, serta menentukan aktivitas enzim lignoselulolitik. Optimasi suhu, pH, dan konsentrasi substrat juga dilakukan, menggunakan Response Surface Methodology (RSM). Trametes versicolor, Pycnoporus cinnabarinus (jamur pelapuk putih), dan Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride (bukan jamur pelapuk putih) digunakan pada penelitian ini. Pretreatment dengan jamur dilakukan dengan menambahkan suspensi spora jamur ke TKKS, kemudian diinkubasi pada suhu 28 oC selama 14 hari.  A.niger InaCC F537 menghasilkan degradasi lignin tertinggi (7,58±1,5%) dan mampu meningkatkan selulosa (33,56%). Aktivitas enzim ligninolitik, Lakase dan MnP tertinggi dihasilkan oleh P. cinnabarinus InaCC F780 (9,26 dan 123,81 U/ml), sedangkan aktivitas LiP tertinggi dihasilkan oleh A.niger InaCC F537 (3276,8 U/ml). Aktivitas enzim selulolitik, CMCase tertinggi dihasilkan oleh P. cinnabarinus sebesar 0,213 U/ml, sementara aktivitas FPase tertinggi dihasilkan oleh A. niger InaCC F537 sebesar 0,556 FPU/ml. Kemampuan jamur memodifikasi struktur kristalin ditunjukkan pada perubahan indeks kristalinitas selulosa hasil analisis XRD. Optimasi pretreatment dengan A.niger dengan hasil degradasi lignin tertinggi didapatkan pada kondisi 30 oC, pH 5, dan 7 gram substrat (14.21 ± 0.50%). Kondisi optimal dalam menghasilkan kenaikan selulosa tertinggi didapatkan pada suhu 25 oC (53,08%). Sakarifikasi menghasilkan gula pereduksi 1,09 gram (36,30% biomassa). Fermentasi menggunakan S. cerevisiae menghasilkan etanol sebesar 0,56%.