Lignin merupakan senyawa polimer yang memiliki aktivitas antioksidan dan dapat ditemukan pada lindi hitam, yakni limbah delignifikasi pada produksi bioetanol generasi kedua. Lignin dalam lindi hitam berupa campuran yang harus diisolasi untuk dapat dimanfaatkan. Iradiasi sinar gamma dapat meningkatkan aktivitas antioksidan lignin untuk meningkatkan manfaatnya, namun perubahan yang disebabkan belum banyak dipelajari. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui proses isolasi lignin dari lindi hitam dengan metode presipitasi asidifikasi dan mengetahui pengaruh iradiasi sinar gamma terhadap karakter dan aktivitas antioksidan dari lignin. Lignin diisolasi dengan HCl 4 M dan kemudian diiradiasi dengan dosis 25 kGy, 50 kGy, dan 75 kGy. Karakterisasi radikal bebas, gugus fungsi, produk degradasi, stabilitas termal, dan aktivitas antioksidan dilakukan dengan ESR, FTIR, Py-GC-MS, DSC, dan metode DPPH secara berturut-turut. Hasil yang didapatkan berupa isolat dengan kadar lignin total sebesar 88,16%. Setelah diiradiasi, karakterisasi menunjukkan bahwa lignin yang diiradiasi mengalami degradasi dan membentuk senyawa-senyawa dan radikal baru, dengan stabilitas termal yang menurun. Nilai IC50 dari lignin tanpa iradiasi dan dengan iradiasi dosis 25 kGy, 50 kGy, dan 75 kGy secara berturut-turut adalah 167,2548 μg/mL, 101,2703 μg/mL, 49,8902 μg/mL, dan 39,2425 μg/mL. Hasil studi menunjukkan bahwa metode presipitasi asidifikasi dapat mengisolasi lignin dari lindi hitam dan terjadi perubahan radikal bebas, gugus fungsi, stabilitas termal, dan produk degradasi setelah lignin diiradiasi dengan sinar gamma, di mana hal tersebut menyebabkan kenaikan aktivitas antioksidan seiring meningkatnya dosis iradiasi.