Black sapote (Diospyros digyna Jacq.) merupakan buah yang kaya manfaat dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Saat ini, keberadaan buah tersebut masih sulit ditemui di pasaran. Selain itu, jenis kelamin black sapote sulit diketahui sejak dini serta data mengenai tanaman tersebut masih sangat terbatas. Analisis keragaman genetik menjadi langkah awal dalam upaya pemuliaan tanaman, salah satunya melalui pendekatan molekuler. Penelitian ini bersifat kualitatif kuantitatif yang dilakukan untuk mengetahui keragaman genetik black sapote berdasarkan marka RAPD serta mendapatkan marka untuk menentukan jenis kelamin tanaman black sapote. Sampel yang digunakan terdiri dari tujuh aksesi black sapote dengan kode sampel diantaranya yaitu P, M1, M2, M3, F1, F2, dan F3. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu ekstraksi dan isolasi DNA, uji kuantitas DNA, amplifikasi PCR menggunakan enam primer RAPD (OPA 02, OPA 05, OPA 08, OPA 09, OPC 09, dan OPD 15), dan elektroforesis untuk memvisualisasikan DNA hasil amplifikasi. Data dianalisis menggunakan software NTSYS 2.02 untuk menghasilkan dendogram melalui metode UPGMA pada fungsi SAHN. Hasil analisis menunjukkan bahwa polimorfisme yang dihasilkan dari tujuh aksesi black sapote berkisar antara 50-80% dengan nilai PIC berkisar antara 0,28-0,50. Aksesi yang paling dekat kemiripannya yaitu M1 dan M2, sedangkan aksesi P dengan F2 memiliki keragaman genetik paling tinggi. Primer OPA 02 dengan pita berukuran 380 bp dapat dijadikan indikator untuk menentukan jenis kelamin betina dan hermaprodit pada tanaman black sapote.