Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penyemprotan dan pencelupan betain terhadap karakteristik tetasan telur Ayam Kampung Unggul Balitbangtan (KUB). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah telur ayam KUB sebanyak 200 butir telur dari satu peternakan yang sama. Penelitian penetasan dilakukan di Laboratorium Ilmu Nutrisi dan Makanan Ternak dan Laboratorium Produksi Ternak Program Studi S1 Peternakan, Fakultas Peternakan, Universitas Sebelas Maret Surakarta mulai bulan Mei sampai September 2023. Desain penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri dari 5 (lima) perlakuan dan 4 (empat) ulangan, setiap ulangan terdapat 10 (sepuluh) butir telur. Perlakuan yang dilakukan pada penetasan telur ayam KUB yaitu telur tanpa adanya perlakuan/kontrol negatif (P0), telur dengan placebo penyemprotan air/kontrol positif (P1), telur dengan penyemprotan betain 2000 mg/L (P2), telur dengan placebo pencelupan air (P3), dan telur dengan pencelupan betain 2000 mg/L (P4). Peubah yang diamati adalah bobot Day Old Chicken (DOC), bobot hati, bobot gizzard, bobot usus halus, panjang usus halus, bobot egg yolk, bobot jantung, dan bobot proventrikulus. Data dianalisis menggunakan Analisis of Variance (ANOVA). Hasil pengamatan penyemprotan dan pencelupan menggunakan betain terhadap karakteristik tetasan telur Ayam KUB berpengaruh tidak nyata (P>0,05) terhadap bobot DOC, bobot hati, bobot gizzard, bobot usus halus, panjang usus halus, bobot jantung, bobot egg yolk, dan bobot proventrikulus. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpukan bahwa penetasan dengan penambahan betain 2000 mg/L memiliki karakteristik hasil tetasan yang sama pada setiap perlakuan.