Biskuit merupakan produk bakeri kering yang dibuat melalui proses pemanggangan adonan dari tepung terigu dengan atau tanpa substitusinya, minyak/lemak, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain dan bahan tambahan pangan. Substitusi quinoa yang memiliki kandungan gizi yang cukup serta bebas gluten dengan penambahan buah bit yang memiliki kandungan senyawa antioksidan yang tinggi serta memiliki pigmen warna yang menarik dapat menjadi kombinasi yang pas untuk dijadikan biskuit gluten free yang kaya akan nilai gizi. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui karakteristik fisik, kimia, dan sensoris serta mengetahui formula terbaik dari biskuit gluten free substitusi tepung quinoa dan tepung buah bit. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 1 faktor. Perbandingan variasi formula tepung quinoa dan tepung buah bit pada penelitian ini yaitu (100:0); (90:10); (80:20); (70:30); (60:40) %b/b tepung quinoa : tepung buah bit. Pada analisis fisik, variasi formula biskuit tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada daya patah biskuit. Semakin banyak substitusi tepung buah bit dapat meningkatkan kekerasan biskuit sebesar 463,67 – 845,73 N; tetapi menurunkan nilai L*, a*, dan b* pada warna biskuit sebesar L* 46,61 – 31,71; a* 12,42 – 10,77; dan b* 27,66 – 13,98. Pada analisis kimia, variasi formula biskuit tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada kadar air biskuit. Semakin banyak substitusi tepung buah bit dapat meningkatkan kadar abu sebesar 3,15 – 5,21%; kadar protein 10,58 – 12,50%; dan kadar betasianin ND – 13,14 ppm; tetapi menurunkan kadar lemak sebesar 19,81 – 18,11%; kadar karbohidrat 66,51 – 63,66%; dan aktivitas antioksidan 89,37 – 78,34%. Pada analisis sensoris, substitusi tepung quinoa dan tepung buah bit pada biskuit gluten free memberikan pengaruh yang signifikan pada tingkat kesukaan warna, aroma, rasa, dan overall namun tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada tingkat kesukaan tekstur. Formulasi terbaik biskuit gluten free substitusi tepung quinoa dan tepung buah bit yaitu formula biskuit F1 dengan persentase substitusi 90% tepung quinoa dan 10% tepung buah bit.