Biskuit dianggap sebagai makanan ringan di semua kalangan usia dan harus dapat diterima oleh banyak orang. Biskuit merupakan produk ideal untuk dikembangkan sebagai alternatif makanan bebas gluten. Kualitas nutrisi produk bebas gluten tetap menjadi perhatian, alternatif penggunaan tepung terigu pada pembuatan biskuit dapat disubtitusi menggunakan tepung quinoa dan tepung labu kuning untuk meningkatkan nilai gizi yang terkandung. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh variasi formulasi tepung quinoa dan tepung labu kuning dalam pembuatan biskuit gluten free terhadap karakteristik fisik meliputi daya patah, kekerasan, dan warna; kimia meliputi kadar air, kadar abu, protein, lemak, karbohidrat, aktivitas antioksidan, serta ß-karoten; dan karakteristik sensoris. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 1 faktor yakni formula tepung quinoa dan tepung labu kuning yang digunakan. Perbandingan variasi formula tepung quinoa dan tepung labu kuning (F0 = 100 : 0), (F1 = 90 : 10), (F2 80 : 20), (F3 70 : 30), dan (F4 60 : 40) (%b/b). Penelitian ini dilakukan 3 kali ulangan sampel dengan 5 formulasi dan 2 kali pengulangan analisis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa variasi formula biskuit tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada analisis fisik seperti kekerasan, daya patah, dan lightness. Semakin banyak substitusi tepung labu kuning dapat menurunkan nilai a*dan b* pada warna biskuit sebesar a* 12,23 – 10,98 dan b* 27,65 – 25,15. Pada analisis kimia, variasi formula biskuit tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada kadar air dan kadar protein biskuit. Semakin banyak substitusi tepung labu kuning dapat meningkatkan kadar abu sebesar 3,15 – 3,83%; kadar karbohidrat sebesar 66,51% - 68,22%; aktivitas antioksidan sebesar 85,97% - 88,57%; dan betakaroten sebesar 13,64 – 81,02 μg/g. Pada analisis sensoris, substitusi tepung quinoa dan tepung labu kuning pada biskuit gluten free memberikan pengaruh yang signifikan pada tingkat kesukaan warna, aroma, rasa, tesktur, dan overall. Formulasi terbaik biskuit gluten free substitusi tepung quinoa dan tepung labu kuning yaitu formula biskuit F1 dengan presentase substitusi 90% tepung quinoa dan 10% tepung labu kuning.