Fungi endofit merupakan organisme yang berpotensi sebagai agen pengendali penyakit pada tanaman. Eksplorasi fungi endofit dari jaringan tanaman yang toleran terhadap suatu penyakit perlu dilakukan untuk memperoleh agen hayati yang tepat untuk pengendalian. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi fungi endofit sengon toleran karat puru sehingga dapat memberikan informasi tentang jenis dan potensi fungi endofit sebagai agen biokontrol penyakit karat puru. Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret–Juli 2023 dan bulan Maret–Juni 2024 di Laboratorium Biologi FMIPA UNS. Sampling dilakukan di hutan sengon yang terletak di  Desa Sampang, Kabupaten Banjarnegara; Desa Wonolelo, Desa Wonosari, dan Desa Pungangan, Kabupaten  Wonosobo; serta Desa Purbasari, Desa Sanguwatang, dan Desa Karangjambu, Kabupaten Purbalingga. Metode sampling yaitu purposive sampling. Isolasi fungi endofit dilakukan dengan menanam sampel batang, akar, dan serabut akar sengon pada media PDA hingga diperoleh biakan murni, kemudian diidentifikasi secara morfologi makroskopis dan mikroskopis, serta secara molekuler berdasarkan sekuen rDNA ITS–1 dan ITS–4. Data penelitian dianalisis menggunakan BLAST dan MEGA 11. Hasil penelitian ini berupa 19 isolat fungi endofit yang terbagi menjadi 15 spesies dari 13 genus yang berbeda. Beberapa isolat fungi endofit berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen hayati dalam pengendalian karat puru. Isolat fungi endofit lainnya diperlukan kajian yang lebih mendalam lagi karena dilaporkan berperan sebagai patogen pada tanaman lain.