Latar Belakang: Anemia merupakan salah satu masalah kesehatan pada remaja putri di Indonesia maupun di seluruh dunia. Prevalensi anemia pada remaja putri menurun tetapi dampak anemia dapat mengganggu pembelajaran dan konsentrasi dalam belajar. Ekstrak alkaloid bunga pukul empat mempunyai kandungan Indicaxanthin, Miraxanthin-V dan Boeravinone-F yang mempunyai peran dalam metabolisme zat besi tetapi konsentrasi Fe dalam ekstrak belum diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian  ekstrak bunga pukul empat terhadap metabolisme zat besi pada tikus betina model anemia (kajian terhadap berat badan, kadar hemoglobin, serum besi, feritin dan aktivitas matriptase-2).Metode: Penelitian eksperimen laboratorium ini dengan pre posttest group design dengan menggunakan 30 ekor tikus Sprague-Dawley betina. Enam ekor tikus kelompok normal (KN) dan 25 dilakukan pemodelan anemia sedang dengan pengambilan darah 1%/BB tikus dan  diet AIN-93M tanpa besi. Kemudian tikus anemia dirandomisasi menjadi 5 kelompok: kontrol positif K (+) diberikan suplemen besi 0,074 ml/200g BB/hari, kontrol negatif K (-) tanpa perlakuan, perlakuan (P1-3) diberikan ekstrak bunga pukul empat 0,34 g, 0,68 g dan 1,36 g/200 g BB/hari selama 6 minggu. BB dan kadar Hb diukur dengan timbangan digital dan hematology analyzer. Kadar serum besi dan feritin ditentukan dengan ELISA kit, sedangkan aktivitas matriptase-2 diukur dengan fluorometer. Data dianalisis menggunakan SPSS versi 25. Analisis data menggunakan uji parametrik dan nonparametrik dengan nilai signifikansi p<0>Hasil: Rerata BB semua kelompok perlakuan meningkat setelah 6 minggu perlakuan. Rerata Hb P1 meningkat dan signifikan dibandingkan dengan K(-) (p<0,001). Rerata serum besi P2 (1,27±0,19 ng/µL) lebih tinggi dan tidak signifikan dibandingkan dengan P1 (p=0,805) dan P3 (p=0,681). Rerata kadar feritin P2 meningkat dan signifikan dibandingkan KN (p=0,001), K(+) (p=0,039) dan P3 (p=0,007). Rerata aktivitas matriptase-2 P1, P2 dan P3 menurun dan signifikan dibandingkan KN, K(+) dan K(-) dengan nilai p<0>Kesimpulan: Ekstrak bunga pukul empat dosis 0,34 g/200 g BB/hari selama 6 minggu meningkatkan BB, kadar Hb dan menurunkan aktivitas matriptase-2 sedangkan dosis 0,68 g/200 g BB/hari meningkatkan serum besi dan feritin pada tikus betina model anemia. Kata Kunci: Ekstrak bunga pukul empat, metabolisme zat besi, remaja putri, anemia.