Tanaman ubi kayu memiliki nilai ekonomi yang signifikan baik sebagai sumber pangan maupun tanaman komersial. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi berbagai kultivar ubi kayu dengan menggunakan metode morfologi dan molekuler. Lima kultivar ubi kayu diidentifikasi di Kabupaten Boyolali, Jawa Tengah: M. esculenta M, U, KP, HM, dan MH. Pengamatan morfologi difokuskan pada daun, batang, dan umbi, mengikuti panduan pada buku Selected Morphological and Agronomic Descriptors for the Characterization of Cassava. Pengamatan molekuler dilakukan dengan menggunakan teknik DNA barcoding, dengan ribulose-bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) dan Internal Transcribed Spacer (ITS) sebagai penanda DNA. Penelitian ini melibatkan beberapa tahap, dimulai dengan isolasi DNA genom menggunakan Plant Geneaid kit, kemudian visualisasi genom DNA dengan elektroforesis dan amplifikasi target gen menggunakan primer universal. Selanjutnya, sequencing Sanger dua arah dilakukan. Sekuens untuk setiap sampel dibandingkan kemiripannya dengan basis data NCBI menggunakan alat BLAST di situs web NCBI. NTSYSpc digunakan untuk menganalisis hubungan berdasarkan ciri-ciri morfologi. Pada saat yang sama, untuk karakteristik molekuler, MEGA11 digunakan untuk memfasilitasi analisis komposisi nukleotida, penghitungan jarak genetik, dan konstruksi pohon filogenetik. Analisis morfologi menunjukkan variasi substansial dalam warna tangkai daun, jarak antar ruas batang, bentuk umbi, dan tekstur kulit umbi. Kelima kultivar ubi kayu menunjukkan tingkat kemiripan genetik yang tinggi dengan M. esculenta, yang ditunjukkan dengan cakupan kueri yang tinggi dan nilai E yang mendekati nol. Khususnya, gen rbcL memiliki kandungan adenin dan timin (AT) yang lebih tinggi yaitu 57,4%, sedangkan gen ITS memiliki kandungan guanin dan sitosin (GC) yang lebih besar yaitu 64,6%.