Matoa (Pometia pinnata) merupakan tanaman penghasil buah yang mempunyai potensi tinggi karena kandungan kalsium, glukosa, mineral, vitamin C, vitamin E, dan beberapa senyawa antioksidan tinggi yang baik bagi kesehatan. Berdasarkan kandungan dalam buah matoa tersebut maka diperlukan pelestarian untuk tanaman asli Papua ini . Perbanyakan matoa memerlukan kondisi lingkungan dan media tanam yang sesuai untuk tumbuh optimal serta tidak terserang patogen jamur dan mengalami pembusukan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kombinasi optimal antara media tanam dan pengaplikasian chitosan terhadap pertumbuhan bibit matoa. Penelitian dilakukan di Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Jebres, Surakarta, Jawa Tengah pada bulan Oktober 2021 - April 2022 menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor: komposisi media tanam perbandingan campuran tanah, pasir, pupuk kompos, dan arang sekam (1:1:1:1, 2:1:1:1, 1:2:1:1, 1:1:2:1) dan konsentrasi chitosan (0 ml/l, 2 ml/l, 5 ml/l ), dengan tiga ulangan. Data dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) taraf 5?n uji DMRT 5% jika berbeda nyata. Hasil penelitian menunjukan bahwa komposisi media tanam berpengaruh nyata pada pertumbuhan tinggi tanaman matoa pada umur 2 – 6 MST dan berat basah brangkasan. Interaksi perlakuan komposisi media tanam dan pengaplikasian chitosan berpengaruh nyata terhadap panjang akar sampel bibit matoa.