Permasalahan sampah di Indonesia belum terselesaikan dan justru meningkat seiring dengan pertumbuhan populasi manusia. Komposisi sampah di Indonesia didominasi oleh limbah organik dan sebagian besar ditangani dengan dibuang langsung ke tempat pembuangan akhir sehingga berpotensi besar menimbulkan pencemaran pada lingkungan. Lingkungan yang tercemar oleh limbah organik akan meningkatkan kehadiran lalat, vektor penular penyakit seperti diare yang dapat menimbulkan kematian terutama bagi anak balita. Limbah kulit buah dan sisa sayuran telah mulai dimanfaatkan sebagai bahan dasar pembuatan eco-enzyme melalui proses fermentasi sederhana sebagai salah satu upaya alternatif pengolahan limbah organik dan menghasilkan produk multifungsi ramah lingkungan. Penelitian ini menganalisis karakteristik eco-enzyme, menentukan konsentrasi optimal eco-enzyme sebagai pengusir lalat, mendeskripsikan persepsi masyarakat Kampung Jatirejo RT 03 RW 39 tentang eco-enzyme dan aplikasinya sebagai pengusir lalat, serta menentukan formulasi optimal eco-enzyme sebagai semprotan pengusir lalat. Metode yang digunakan adalah penelitian eksperimen berupa uji kualitas eco-enzyme dengan uji organoleptik fisiko-kimia, uji fitokimia kualitatif, dan analisis GC-MS, serta uji repelensi terhadap lalat berskala laboratorium dengan rancangan acak lengkap. Selanjutnya, dilakukan penelitian deskriptif kualitatif dengan pelaksanaan sosialisasi dan pembagian kuesioner yang mengacu pada heath belief model. Hasil penelitian menunjukkan bahwa eco-enzyme yang dihasilkan berkualitas baik dengan nilai pH di bawah 4, beraroma asam, manis, dan segar, mengalami penyusutan volume, serta mengandung metabolit sekunder seperti terpenoid, flavonoid, alkaloid, tanin, hingga sejumlah asam lemak, ester, dan hidrokarbon. Eco-enzyme 3?ngan nilai repelensi 60?lam kategori kelas III (average repellent) ditemukan sebagai konsentrasi optimal eco-enzyme dalam mengusir lalat. Sementara itu, persepsi masyarakat Kampung Jatirejo RT 03 RW 39 tentang eco-enzyme dan aplikasinya sebagai pengusir lalat ditemukan cukup baik. Masyarakat menunjukkan respons positif melalui pemahaman terhadap melimpahnya limbah organik dan kehadiran lalat sebagai akar masalah, serta eco-enzyme sebagai alternatif solusinya. Formulasi optimal eco-enzyme 3% sebagai pengusir lalat dengan total volume 100 mL diperoleh dengan mencampurkan 3 mL cairan eco-enzyme pekat dengan 97 mL air keran.