Tongkol jagung termasuk salah satu limbah padat yang dihasilkan oleh pertanian maupun industri pengolahan jagung. Tongkol jagung diketahui mengandung xilan yang berperan sebagai sumber karbon bagi mikroorganisme penghasil xilanase. Xilan dapat dihidrolisis oleh enzim xilanase menjadi xilosa dan xilooligosakarida. Penelitian ini bertujuan menentukan kondisi optimum, meliputi waktu inkubasi, suhu dan pH untuk produksi xilanase oleh bakteri Stenotrophomonas maltophilia strain Y28 dengan substrat tongkol jagung. Perlakuan pendahuluan serbuk tongkol jagung dilakukan dengan menggunakan pelarut NaOCl 15% dan NaOH. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan selama 48 jam. Kadar gula reduksi diukur menggunakan metode DNS dan aktivitas xilanase dihitung dengan metode Ghose. Optimasi suhu dilakukan pada variasi suhu 30, 40, 50 dan 60 (oC), dan dilanjutkan optimasi pH dilakukan pada variasi pH 7, 8, 9 dan 10. Data penelitian yaitu waktu inkubasi, suhu dan pH optimum dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Produksi xilanase oleh S. maltophilia strain Y28 dengan substrat tongkol jagung optimum pada waktu inkubasi 8 jam, suhu 50oC dan pH 9 dengan aktivitas enzim sebesar 8,42 U/ml.