Latar Belakang: Penyakit Tuberkulosis (TB) masih menjadi masalah kesehatan globalkarena menjadi penyebab utama penyakit infeksi yang menyebabkan kesakitan dan kematian.Di negara yang berpenghasilan rendah pemeriksaan mikroskopis dengan Zielh-Neelsenmerupakan alat yang ideal untuk penegakan diagnosis maupun memantau hasil pengobatanpasien TB. Pelatihan petugas yang terlibat pemeriksaan mikroskopis TB sangat penting untukmeningkatkan profesionalisme. Tujuan penelitian untuk menganalisis factor yangmemepengaruhi kualitas sediaan mikroskopis TB di Kabupaten Madiun, Jawa Timurmenggunakan multilevel analisis.Subjek dan Metode: Desain analitik observasional dengan pendekatan cross-sectional. Penelitian di 23 Puskesmas di Kabupaten Madiun pada bulan Maret hingga April 2018. Besarsampel 230 subjek, dengan menggunakan stratified random sampling pada level Puskesmasdan simple random sampling pada level individu. Variabel dependen yaitu kualitaspembuatan sediaan mikroskopis TB. Variabel independen yaitu masa kerja, pelatihan danakreditasi Puskesmas. Pengumpulan data menggunakan kuesioner. Analisis datamenggunakan analisis multilevel.Hasil: Masa kerja (b=2.77; CI95%=0.81 hingga 4.73; p=0.006), dan akreditasi Puskesmas(b=3.06; CI95%=0.81 hingga 4.62; p=0.000), mempunyai pengaruh secara statistik signifikanterhadap kualitas pembuatan sediaan sedangkan pelatihan (b=-0.51; CI95%= -2.33 hingga1.32; p=0.58) tidak mempunyai pengaruh secara statistik signifikan terhadap kualitaspembuatan sediaan. Variasi pada level Puskesmas menunjukkan pengaruh kontekstual yangkuat dengan nilai Intraclass Correlation (ICC) 22,01%.Kesimpulan: Terdapat pengaruh masa kerja dan akreditasi Puskesmas terhadap kualitaspembuatan sediaan sedangkan pelatihan tidak berpengaruh terhadap kualitas pembuatansediaan. Variasi pada level Puskesmas menunjukkan pengaruh kontekstual yang kuatterhadap kualitas pembuatan sediaan mikroskopis TB.