Pendahuluan: Efek sitotoksik kemoterapi pada pasien lekemia akut menyebabkan supresi produksi netrofil yang dapat meningkatkan risiko infeksi jamur. Turnaround time yang panjang merupakan keterbatasan kultur. Real time polymerase chain reaction (rtPCR) merupakan pemeriksaan molekuler yang cepat dan dapat mendeteksi mikroorganisme yang tidak dapat tumbuh pada kultur. Tujuan penelitian ini untuk melihat performa diagnostik rt-PCR dalam mendeteksi infeksi jamur pada pasien lekemia akut dengan kemoterapi.   Metode: Penelitian analitik observasional dengan pendekatan cross sectional pada 63 pasien lekemia akut dengan kemotetapi disertai kecurigaan infeksi jamur di Rumah Sakit  Dr. Moewardi di Surakarta pada bulan April sampai Juni 2019. Sampel darah diinokulasi pada botol kultur untuk pertumbuhan jamur dan tabung EDTA untuk pemeriksaan rtPCR. Sensitivitas, spesifisitas, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), akurasi, negative likelihood ratio (NLR) dan positive likelihood ratio (PLR) untuk melihat performa diagnostik rt-PCR. Hasil: Performa diagnostik metode rt-PCR dalam mendeteksi infeksi jamur pada pasien lekemia akut dengan kemoterapi dibandingkan dengan metode kultur jamur didapatkan hasil sensitivitas 50%, spesifisitas 75,4%, NDP 6,3%, NDN 97,9%, akurasi 74,6%, PLR 2,0 dan NLR 0,7. Simpulan : Sensitivitas dan spesifisitas real time PCR pada penelitian ini didapatkan kurang dari 85 ?lam mendeteksi infeksi jamur pada pasien lekemia akut dengan kemoterapi.