Kitooligosakarida merupakan derivat dari kitosan yang memiliki sifat antimikroba dan dijadikan bahan aktif dalam cairan hand sanitizer sehingga produk hand sanitizer yang dihasilkan bebas alkohol. Hand sanitizer bebas alkohol dapat menghindari terjadinya toleransi bakteri terhadap bahan kimia seperti alkohol dan mengurangi efek buruk alkohol bagi kulit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik sediaan hand sanitizer kitooligosakarida dan efektivitasnya dalam membunuh mikroba. Serbuk kitooligosakarida ditambahkan dalam formulasi hand sanitizer dengan variasi berat 3 g, 6 g, dan 9 g ditambah basis NaCMC, propilenglikol, essens, dan metil paraben. Evaluasi stabilitas fisik hand sanitizer berdasarkan warna, tekstur, aroma, pH, homogenitas, dan daya sebar. Uji daya hambat hand sanitizer diuji melalui metode disc diffusion dilanjutkan dengan perbandingan daya hambat melalui pengukuran diameter zona penghambatan dan uji one-way ANOVA. Uji penurunan angka koloni mikroba dengan metode swabbing dan dihitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dilanjutkan perbandingan rerata penurunan koloni mikroba melalui uji T berpasangan. Hasil evaluasi stabilitas fisik hand sanitizer memenuhi kriteria gel yang baik. Formula 1 memiliki kriteria daya hambat yang lemah pada S. aureus dan daya hambat sedang pada E. coli, Formula 2 dan 3 memiliki daya hambat kuat pada kedua jenis bakteri. Hasil penurunan angka koloni mikroba sediaan hand sanitizer paling besar yaitu formula 3 sebesar 80,22%. Dapat disimpulkan bahwa hand sanitizer kitooligosakarida memiliki kemampuan menurunkan angka koloni mikroba dan dapat digunakan sebagai formulasi alternatif hand sanitizer.