Pisang (Musa paradisiaca L.) adalah salah satu jenis buah-buahan tropis yang dapat tumbuh subur hampir diseluruh wilayah Indonesia. Komoditas pisang banyak digemari masyarakat karena pisang merupakan sumber vitamin, mineral dan juga karbohidrat. Budidaya pisang secara konvensional masih mengalami kendala terutama faktor lingkungan, musim dan adanya serangan hama serta penyakit di lapangan. Perbanyakan secara kultur jaringan bertujuan untuk menghasilkan  bibit secara cepat, seragam, bebas penyakit, tidak tergantung musim serta hasil yang dihasilkan tinggi.

Penelitian bertujuan untuk Mendapatkan konsentrasi IAA terbaik pada media MS dalam subkultur tanaman pisang Ambon Kuning secara in vitro, mendapatkan konsentrasi air kelapa terbaik pada media MS dalam subkultur tanaman pisang Ambon Kuning secara in vitro dan untuk mendapatkan kombinasi konsentrasi IAA dan air kelapa terbaik pada media MS dalam subkultur tanaman pisang Ambon Kuning secara in vitro. Penelitian dilaksanakan pada bulan April – Oktober 2021 di Laboraturium Fisiologi dan Bioteknologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktor dengan dua belas kombinasi perlakuan yang diulang tiga kali. Faktor pertama adalah penambahan IAA ( konsentrasi 0 ppm; 0,5 ppm; 0,75 ppm;1 ppm) dan faktor kedua adalah penambahan Air kelapa (konsentrasi 200 ml/l, 225 ml/l, 250 ml/l) sehingga terdapat 12 kombinasi perlakuan dan masing – masing diulang sebanyak 3 kali. Variabel yang diamati meliputi waktu muncul tunas, jumlah tunas, tinggi tunas, waktu muncul daun, jumlah daun, waktu muncul akar, jumlah akar, panjang akar. Analisis data yang digunakan untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan pada pertumbuhan pisang Ambon secara in vitro menggunakan analisis ragam (Anova) dengan uji F pada taraf 5%, dan apabila terdapat beda nyata dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan (DMRT) pada taraf 5%.

Hasil penelitian menunjukan Perlakuan pemberian IAA berpengaruh nyata terhadap jumlah tunas dan jumlah akar. IAA 0 ppm menghasilkan jumlah tunas terbanyak yaitu sebanyak 5,78 tunas dan menghasilkan jumlah akar terbanyak sebanyak 14,89 akar. Perlakuan pemberian air kelapa berpengaruh nyata terhadap rata-rata waktu kemunculan daun. Air kelapa mempercepat waktu muncul daun pada konsentrasi 225 ml/l yaitu 13,17 HST. Kombinasi media yang mengandung IAA 0 ppm dan air kelapa 200 ml/l mampu menghasilkan jumlah akar 21,00 akar. Kombinasi media yang mengandung IAA 0,5 ppm dan air kelapa 200 ml/l mampu menghasilkan panjang akar 16,33 cm.