Aktivitas antibakteri terjadi ketika suatu zat dapat menghambat pertumbuhan, mencegah pembentukan koloni, dan merusak bakteri patogen. Namun, penggunaan antibakteri dengan dosis berlebihan dan kurang tepat dapat mempercepat evolusi bakteri resisten. Resistensi meningkatkan minat untuk mengeksplorasi keberagaman antibakteri. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas antibakteri alami yang berasal dari daun barus (D. aromatica). Daun ini diketahui mengandung senyawa ?-terpineol, terpinen-4-ol, globulol, dan ?-pinene. Tujuan penelitian ini yaitu mengetahui daya hambat, nilai Minimum Inhibition Concentration (MIC), nilai Minimum Bactericidal Concentration (MBC), dan senyawa bioaktif dalam ekstrak daun barus (D. aromatica). Penelitian ini menggunakan metode uji kertas cakram, mikodilusi broth, dilusi agar, dan GC-MS. Pada uji kertas cakram, konsentrasi ekstrak yang digunakan sebesar 50%, 25%, 10%, dan 1%. Apabila terdapat zona hambat, maka uji dilanjutkan untuk menentukan MIC dan MBC. Konsentrasi ekstrak yang digunakan pada uji MIC dan MBC sebesar 10%; 5%; 2,5%; 1,25%; dan 0,625%. Zona hambat ditemukan pada bakteri S. epidermidis sebesar 9,19 mm (50%); 8,83 (25%); dan 8,53 mm (10%) serta bakteri S. pyogenes sebesar 13,53 (50%); 12,13 mm (25%); 11,80 mm (10%), dan 8,52 mm (1%). Nilai MIC terhadap bakteri S. epidermidis dan S. pyogenes sebesar 0,625%. Nilai MBC terhadap bakteri S. epidermidis sebesar 5% (bakteriostatik) dan bakteri S. pyogenes sebesar 0,625% (bakterisidal). Hasil uji GC-MS menujukkan bahwa konstituen utama ekstrak daun barus (D. aromatica) antara lain Methyl (7E,10E,13E)-7,10,13-hexadecatrienoate (33.91%), 2- Isopropyl-5 methylcyclohexanol (28,74%), dan Methyl isohexadecanoate (12,32%).