Biduri (Calotropis gigantea) merupakan jenis tanaman perdu. Senyawa aktif yang berada pada biduri dapat dimanfaatkan sebagai obat-obatan namun pemanfaatannya masih kurang optimal sehingga perlu adanya upaya perbanyakan secara in vitro. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi ZPT BAP dan IBA yang optimal dalam merangsang pertumbuhan, kandungan flavonoid, dan senyawa kimia lain pada biduri secara in vitro. Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) disusun secara faktorial terdiri dari 2 faktor perlakuan dengan 25 kombinasi perlakuan dan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Faktor pertama adalah konsentrasi BAP (0, 1, 2, 3, dan 4 ppm) dan faktor kedua adalah konsentrasi IBA (0, 1, 2, 3, dan 4 ppm). Hasil penelitian menunjukkan bahwa interaksi BAP dan IBA terlihat pada waktu muncul tunas dan jumlah daun. Konsentrasi BAP 4 ppm mampu meningkatkan jumlah tunas, persentase induksi kalus, warna kalus dominan hijau dan bertekstur kompak. Konsentrasi BAP 0 ppm memberikan rata-rata tertinggi pada persentase muncul akar, meningkatkan jumlah akar, waktu muncul kalus, dan tinggi planlet. Tanaman biduri yang dibudidaya secara in vitro tanpa pemberian BAP dan IBA memiliki kandungan flavonoid yang lebih tinggi dan terdapat perbedaan macam senyawa bioaktif antara biduri yang dibudidaya secara in vitro dan konvensional.