Daun sambiloto mengandung senyawa andrographolide dan flavonoid yang dapat digunakan sebagai antibakteri. Sediaan spray handsanitizer ekstrak etanol daun sambiloto merupakan sediaan dengan teknik semprot yang dapat digunakan sebagai antiseptik. Ekstrak daun sambiloto diformulasikan kedalam sediaan spray sebagai bahan aktif antibakteri yang berasal dari tumbuhan herbal sebagai pengganti alkohol. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui karakteristik sediaan spray handsanitizer ekstrak daun sambiloto serta mengetahui aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Ekstrak daun sambiloto ditambahkan dalam formulasi sediaan spray handsanitizer dengan variasi konsentrasi 10%, 15%, 20% dan ditambah basis karbopol 940, trietanolamine, propil paraben, propilenglikol dan metil paraben. Evaluasi fisik spray handsanitizer berdasarkan warna, tekstur, aroma, pH, homogenitas, dan daya lekat. Daya hambat sediaan spray handsanitizer ditentukan berdasarkan diameter zona penghambatan pada metode difusi.

Hasil evaluasi fisik spray handsanitizer memenuhi kriteria spray yang baik. Ketiga formula sediaan spray memiliki kemampuan daya hambat terhadap S. aureus dengan kategori daya hambat yang lemah (<0>spray handsanitizer paling besar yaitu F3 sebesar 59,25%. Berdasarkan analisis ANCOVA, terdapat perbedaan nyata antar perlakuan spray yang dipengaruhi oleh perbedaan covariate. Berdasarkan analisis paired t-test, terdapat perbedaan nyata antara jumlah bakteri sebelum perlakuan spray dan jumlah bakteri setelah perlakuan spray.

Kata Kunci: Antibakteri, Sambiloto, Spray handsanitizer