Selada (Lactuca sativa) merupakan salah satu tanaman sayuran daun yang banyak dibudidayakan pada lahan perkotaan dengan media hidroponik. Penyakit busuk akar selada (Pythium dissotocum) merupakan salah satu kendala utama dalam budidaya selada hidroponik sistem sumbu. Upaya pengendalian patogen ini oleh petani lokal umumnya dilakukan dengan cara membuang larutan nutrisi dan tanaman sakit. Alternatif pengendalian dapat dilakukan dengan aplikasi agen hayati. Penelitian ini bertujuan mengkaji efektivitas Trichoderma spp., mikoriza, dan Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) terhadap penyakit busuk akar selada (P. dissotocum) serta pertumbuhan dan produksi selada pada hidroponik sistem sumbu. Penelitian dilaksanakan di Desa Waru, Baki, Sukoharjo dan Laboratorium Hama Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta pada bulan Januari sampai Mei 2022. Penelitian dilakukan menggunakan Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL) faktorial yang terdiri dari dua faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama merupakan jenis agen hayati, yaitu Trichoderma spp., mikoriza, dan PGPR. Faktor kedua adalah interval aplikasi agen hayati, yaitu aplikasi 1 minggu sebelum dan setelah inokulasi P. disssotocum. Pengamatan peubah pada penelitian ini meliputi peubah penyakit dan pertumbuhan selada. Peubah penyakit meliputi masa inkubasi, insidensi dan keparahan penyakit, luas bawah kurva perkembangan penyakit (LBKPP), serta nilai efektivitas pengendalian penyakit. Peubah pertumbuhan selada meliputi tinggi tanaman, jumlah daun, panjang akar, bobot segar selada, serta bobot segar dan kering akar. Analisis data menggunakan analisis ragam taraf 5% dan apabila terdapat pengaruh yang signifikan dilanjutkan dengan DMRT pada taraf 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PGPR memberikan hasil terbaik pada nilai efektifitas pengendalian penyakit busuk akar selada (P. dissotocum) sebesar 44,80% pada 28 HSI. PGPR mampu menunda masa inkubasi sebesar 43,48%, keparahan penyakit terendah sebesar 37,04%. Sementara, interval aplikasi agen hayati terbaik ditunjukkan pada 1 minggu sebelum inokulasi dengan keparahan penyakit terendah 41,73%. Aplikasi PGPR pada 1 minggu sebelum inokulasi menunjukkan nilai LBKPP terendah sebesar 381,11%, serta memberikan pertumbuhan tinggi selada tertinggi dari 31 hingga 52 HSS, sebesar 38,47 cm. Aplikasi mikoriza 1 minggu sebelum inokulasi memberikan hasil terbaik pada masa awal tanam (31 HSS), dengan tinggi selada 15,70 cm dan jumlah daun 9,87 helai. Aplikasi Trichoderma spp. 1 minggu sebelum inokulasi memberikan hasil tertinggi pada panjang akar, sebesar 23,21 cm pada 52 HSS. Perlakuan PGPR menunjukkan hasil terbaik pada aspek hasil panen selada, dengan bobot segar selada 130,04 g, bobot segar akar 17,50 g, dan bobot kering akar 0,51 g.