Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan instrumen tes diagnostik Two-Tier Multiple Choice (TTMC) yang berbasis Higher Order Thinking Skills (HOTS) untuk mengetahui pemahaman konsep peserta didik SMP kelas VIII pada materi sistem gerak makhluk hidup. Pada materi sistem gerak makhluk hidup perlu dikembangkan lagi karena peserta didik masih kesulitan dalam memahami konsep sehingga diperlukan suatu alat yang dapat memecahkan masalah tersebut. Metode penelitian yang digunakan yaitu penelitian Research and Development (R&D) dengan desain penelitian menggunakan model Plomp (1997) yang terdiri dari 5 tahap yaitu : (1) preliminary investigation, (2) design, (3) realization/construction, (4) evaluation and revision phase, dan (5) implementation. Subjek penelitian ini adalah peserta didik kelas VIII SMP N 2 Kudus yang diambil dengan teknik simple random sampling dengan menggunakan rumus slovin. Metode pengumpulan data dilakukan dengan cara observasi dan wawancara, tes two-tier untuk mengetahui pemahaman konsep peserta didik, dan angket tanggapan peserta didik untuk mengetahui kepraktisan instrumen yang dikembangkan. Instrumen yang dikembangkan dilakukan uji validitas oleh pakar instrumen. Terdapat dua tahap uji coba yaitu uji coba skala terbatas dan uji coba skala lapangan. Teknik analisis data menggunakan analisis model Rasch. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil validasi instrumen oleh pakar instrumen menunjukkan rata-rata nilai sebesar 78,75 % masuk pada kategori yang baik, sedangkan hasil validasi angket menunjukkan rata-rata nilai sebesar 85,58 % masuk pada kategori sangat baik. Hasil analisis data pada instrumen menunjukkan bahwa (1) tidak ada butir soal yang bias ditinjau dari jenis kelamin, (2) nilai person reliability 0,73 dan 0,71 (cukup), (3) nilai item reliability 0,85 dan 0,94 (bagus), (4) nilai cronbach alpha sebesar 0,79 dan 0,71 (Bagus), dan (5) tingkat kesulitan soal dibagi menjadi empat yaitu kategori mudah, sedang, sulit, dan sangat sulit. Hasil dari profil pemahaman konsep peserta didik pada materi sistem gerak makhluk hidup menunjukkan nilai sebesar 45% peserta didik paham konsep, 16% peserta didik mengalami miskonsepsi positif, 13% peserta didik mengalami miskonsepsi negatif, dan 26% peserta didik tidak paham konsep. Berdasarkan hasil dari penelitian, pengembangan instrumen tes diagnostik berbasis HOTS memenuhi syarat sebagai instrumen tes yang layak digunakan untuk mengetahui pemahaman konsep peserta didik SMP kelas VIII pada materi sistem gerak makhluk hidup.