Penyakit antraknosa yang disebabkan oleh Colletotrichum sp. merupakan kendala utama dalam budidaya cabai rawit (Capsicum frutescens) yang menyebabkan kerugian hasil secara signifikan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efektivitas daya hambat beberapa isolat jamur dalam menekan pertumbuhan Colletotrichum sp. secara in vitro. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Perlindungan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. Pengambilan sampel dilakukan pada lahan cabai rawit di Kabupaten Sukoharjo dan Karanganyar, Jawa Tengah. Penelitian berlangsung dari bulan Juni hingga Desember 2025. Metode yang digunakan adalah metode biakan ganda (dual culture) pada media Potato Dextrose Agar (PDA), yang melibatkan Trichoderma harzianum, Gliocladium sp., Nigrospora sp., dan tiga isolat jamur endofit. Data hasil uji biakan ganda dianalisis menggunakan Analisis Varians (ANOVA) dan uji lanjut DMRT (Duncan's Multiple Range Test) pada taraf kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa seluruh isolat jamur yang diuji memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan C. gloeosporioides secara in vitro. Tingkat efektivitas dikategorikan tinggi (51–75%) pada Endofit 2, T. harzianum, dan Gliocladium sp.; sedang (26–50%) pada Nigrospora sp.; serta rendah (0–25%) pada Endofit 1 dan Endofit 3. Dapat disimpulkan bahwa Endofit 2, T. harzianum, dan Gliocladium sp. merupakan agen antagonis yang paling efektif dalam menekan pertumbuhan C. gloeosporioides secara in vitro.