Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis variasi genetik gen Growth Hormone (GH) dan Pituitary-specific Transcription Factor 1 (PIT-1) serta hubungannya dengan sifat pertumbuhan ayam Kedu. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari hingga Juli 2025 di Balai Budidaya dan Pembibitan Ternak Terpadu Taman Ternak Ayam Maron, Temanggung dan Laboratorium Produksi Ternak, Fakultas Peternakan Universitas Sebelas Maret Surakarta. Sebanyak 60 sampel darah ayam Kedu generasi pertama dianalisis menggunakan metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi EcoRV untuk gen GH dan EcoRI untuk gen PIT-1. Produk PCR berukuran 339 bp untuk GH dan 442 bp untuk PIT-1, dengan suhu annealing 55°C. Hasil menunjukkan bahwa masing-masing gen memiliki dua alel (G dan A pada GH; C dan T pada PIT-1) dan tiga genotipe (GG, AG, AA dan CC, CT, TT). Frekuensi alel dominan pada GH adalah G (0,72) dan pada PIT-1 adalah C (0,78). Gen GH tidak berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg, sedangkan PIT-1 berada dalam kondisi seimbang. Nilai heterozigositas observasi pada kedua gen lebih rendah dari ekspektasi. Analisis asosiasi menunjukkan bahwa gen GH berpengaruh signifikan terhadap lebar dada ayam betina (P = 0,008), dan gen PIT-1 berasosiasi signifikan terhadap rentang sayap ayam jantan (P = 0,04). Hasil ini menunjukkan bahwa variasi genetik pada gen GH dan PIT-1 dapat mempengaruhi karakter pertumbuhan tertentu dan berpotensi diterapkan dalam program seleksi genetik ayam lokal.