Nyeri merupakan respons fisiologis kompleks yang umum terjadi pada berbagai kondisi klinis, sehingga diperlukan alternatif analgesik alami dengan efektivitas tinggi namun efek samping minimal. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi efektivitas metode Natural Deep Eutectic Solvent–Ultrasonic Assisted Extraction (NADES-UAE) terhadap kadar flavonoid total serta aktivitas analgesik in vivo ekstrak buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC). Penelitian ini menggunakan variasi pelarut NADES berbasis glukosa:gliserol (1:3 v/v) dan pelarut non-NADES yaitu etanol 96% untuk menilai kemampuan masing-masing pelarut dalam mengekstraksi senyawa flavonoid. Metode NADES berbasis glukosa:gliserol (1:3 v/v) dipilih karena bersifat biodegradable dan efisien dalam mengekstraksi senyawa flavonoid, menjadikannya pendekatan ekstraksi hijau yang potensial.Ekstraksi NADES-UAE dilakukan pada suhu 30°C selama 15 menit dengan bantuan ultrasonikasi. Kadar flavonoid diukur menggunakan metode kolorimetri dengan pereaksi AlCl₃ dan standar kuersetin, sedangkan uji analgesik dilakukan dengan metode hotplate pada mencit jantan galur BALB/c. Data dianalisis menggunakan ANOVA dilanjutkan dengan uji Tukey’s pada taraf signifikansi p < 0,05.Hasil menunjukkan kadar flavonoid total menggunakan NADES 0,000427 ± 0,000014 mg QE/30g ekstrak serta aktivitas analgesik yang tinggi dengan efek maksimum 44,29% pada menit ke-90, dan tidak berbeda signifikan dengan natrium diklofenak (p = 0,9959). Flavonoid diduga bekerja melalui inhibisi enzim siklooksigenase dan penurunan sintesis prostaglandin. Dengan demikian, ekstraksi NADES-UAE efektif menghasilkan kandidat analgesik herbal alami yang ramah lingkungan namun masih memerlukan pengujian toksisitas dan keamanan secara farmakologis lebih lanjut.