Pemalsuan pangan hewani dan cemaran bahan lain secara sengaja yang tidak diinformasikan dalam kemasan menjadi sangat penting untuk melindungi hak-hak konsumen, salah satu cara yang dapat dilakukan ialah deteksi spesies berbasis DNA. Quantitative PCR merupakan teknik untuk mendeteksi DNA yang bersifat sensitif dan efisien dibandingkan dengan teknik deteksi lainnya. Tujuan penelitian ini ialah mendeteksi spesies ayam yang terdapat pada makanan menggunakan quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Penelitian ini dilaksanakan di BRIN Playen, Yogyakarta pada periode waktu Juni hingga Oktober 2023. Sampel DNA dalam penelitian ini berasal dari daging segar ayam, sapi, dan babi. Primer desain berasal dari gen COX3 pada DNA mitokondria (mtDNA) ayam. Penerapan metode penelitian diawali dengan ekstraksi DNA, amplifikasi dan validasi primer yang terdiri dari repitabilitas, spesifisitas, dan sensitivitas (Limit of Detection). Hasil pengujian menunjukkan bahwa primer berhasil teramplifikasi pada suhu 81,26°C dengan Cq 13,18±0,19 menggunakan 39 ng/µL DNA ayam pada 30 siklus. Limit of Detection atau uji sensitivitas menunjukkan primer dapat mengamplifikasi secara akurat hingga konsentrasi DNA 0,039 ng/µL dan menempel secara spesifik pada DNA target yaitu ayam. Kesimpulannya, primer ayam gen COX3 menggunakan metode qPCR dapat menjadi kandidat biomarker dan studi baru dalam deteksi spesies ayam pada daerah mtDNA.