Sintesis hijau nanopartikel perak berbasis gelatin dan supernatan Gordonia sp. (GG-AgNPs) telah berhasil dilakukan dan diaplikasikan sebagai agen antibakteri. Sintesis dilakukan secara satu tahap menggunakan kombinasi gelatin dan supernatan Gordonia sp. sebagai agen pereduksi sekaligus capping agent dalam pembentukan GG-AgNPs. Pengaruh dari kombinasi kedua agen ditinjau secara real-time melalui karakterisasi spektrofotometer UV-visible (UV-Vis). Produk optimal dikarakterisasi lanjut menggunakan Particle Size Analyzer (PSA), zeta potential, Transmission Electron Microscope (TEM), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-Ray Diffraction (XRD), dan Scanning Electron Microscope – Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy (SEM-EDX). Perubahan sifat optik sebagai ciri khas terbentuknya GG-AgNPs diamati puncak serapan UV-Vis (λmax) antara 380 – 420 nm. Ukuran hidrodinamik GG-AgNPs sebesar 34,76 nm dengan kestabilan yang cukup baik. Morfologi GG-AgNPs berbentuk quasi-spherical dengan rata-rata ukuran 19,55 nm tertanam dalam basis campuran polimer gelatin dan supernatan Gordonia sp. Gugus fungsi yang terlibat dalam sintesis GG-AgNPs mengindikasikan adanya pergeseran puncak gugus karbonil (-C=O), hidroksi (-OH), dan amina (-NH-) dari spektra gelatin dan supernatan Gordonia sp. yang bertanggung jawab terhadap interaksi proses reduksi ion perak dan capping AgNPs. Kristalinitas GG-AgNPs bersesuaian dengan JCPDS perak yang memiliki bentuk struktur face center cubic (FCC) dan ukuran kristalin sebesar 1,27 nm. Selain itu, evaluasi tingkat kehijauan dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif yang menunjukkan tingkat kehijauan berada pada nilai ideal mendekati optimal. Hasil uji aktivitas antibakteri GG-AgNPs menunjukkan lebih baik terhadap bakteri S. aureus ATCC 2923 daripada E. coli ATCC 2922.