Matoa (Pometia pinnata) mengandung antioksidan untuk meningkatkan sistem imun tubuh manusia. Perbanyakan matoa secara konvensional mengalami permasalahan daya simpan benih (biji). Metode kultur in vitro menjadi solusi mengatasi masalah tersebut. Penelitian ini bertujuan mengetahui perlakuan terbaik penggunaan jenis media dan zat pengatur tumbuh (ZPT) terhadap pertumbuhan eksplan embrio matoa.  Penelitian dilaksanakan di Sublab Kultur Jaringan, Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. Rancangan penelitian yaitu  rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari 2 faktor perlakuan. Faktor pertama adalah jenis media yaitu Murashige dan Skoog (MS) dan Woody Plant Medium (WPM). Faktor kedua adalah penggunaan ZPT yang terdiri dari empat taraf yaitu  0 ppm, Benzyl Amino Purin (BAP) 4 ppm, Naphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5 ppm, BAP 4 ppm + NAA 0,5 ppm. Penelitian ini menggunakan 5 kali ulangan. Variabel pengamatan adalah waktu muncul akar, jumlah akar, waktu muncul daun, jumlah daun, waktu muncul kalus, warna kalus dan tekstur kalus. Data hasil pengamatan dianalisis menggunakan Analysis of Varians (ANOVA) dengan uji F 5%, apabila terdapat perlakuan berbeda nyata dilanjutkan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan NAA 0,5 ppm merupakan perlakuan terbaik terhadap jumlah akar (9,1 akar). Interaksi media WPM + ZPT 0 ppm merupakan perlakuan terbaik terhadap waktu muncul daun (4,4 HST), tetapi tidak berbeda nyata dengan interaksi perlakuan MS + ZPT 0 ppm, MS + BAP 4 ppm, WPM + BAP 4 ppm, dan WPM + NAA 0,5 ppm. Perlakuan ZPT 0 ppm menghasilkan waktu muncul daun terbaik (4,9 HST) yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan BAP 4 ppm. Jumlah daun tertinggi pada perlakuan BAP 4 ppm (5,3 daun) yang tidak berbeda nyata dengan perlakuan ZPT 0 ppm dan NAA 0,5 ppm. Kualitas kalus terbaik dengan warna putih kecokelatan dan tekstur intermediet pada perlakuan WPM + BAP 4 ppm.