Infeksi akibat bakteri resisten antibiotik semakin sulit diatasi, salah satunya adalah infeksi Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanopartikel perak (AgNPs) dianggap mampu menjadi alternatif pencegahan infeksi MRSA melalui aplikasinya sebagai lapisan atau komposit pada alat-alat medis di rumah sakit. Ekstrak kulit jeruk manis Baby Java (Citrus sinensis (L.) Osbeck) berpotensi sebagai reduktor dalam biosintesis AgNPs. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui konsentrasi optimum AgNO3 sebagai prekursor dan ekstrak kulit jeruk manis sebagai reduktor dalam biosintesis Cs-AgNPs, mengetahui ukuran Cs-AgNPs, dan mengkaji aktivitas antibakterinya terhadap MRSA. Preparasi diawali dengan kulit jeruk manis dioven pada 60°C selama 48 jam, kulit jeruk yang telah kering dihaluskan hingga berbentuk bubuk dan sebanyak 20 gram bubuk dilarutkan dalam 200 mL akuades. Ekstraksi dilakukan dengan sonikasi pada frekuensi 60 kHz selama 30 menit dan ekstrak disaring dengan kertas saring Whatman No. 42. Biosintesis Cs-AgNPs dilakukan dengan empat variasi konsentrasi ekstrak kulit jeruk manis (10%, 15%, 20%, dan 30%) yang ditambahkan ke dalam dua variasi konsentrasi AgNO3 (1 mM dan 1 M), lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam dalam kondisi gelap. Hasil penelitian menunjukkan biosintesis optimal Cs-AgNPs terjadi pada AgNO3 1 mM dengan penambahan ekstrak kulit jeruk manis 10% dan 15% yang dibuktikan dengan puncak absorbansi 442 nm dan 431 nm pada panjang gelombang 370–500 nm, serta ukuran diameter partikel sebesar 108.2 nm dan 46.68 nm. Cs-AgNPs (1 mM) dengan konsentrasi ekstrak 10% dan 15% menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap MRSA, ditandai dengan terbentuknya diameter zona bening di sekitar kertas cakram sebesar 12.5 mm dan 4.1 mm. Cs-AgNPs (1 mM) dengan konsentrasi ekstrak 10% lebih efektif dalam menghambat MRSA.