Biji kesumba (Bixa orellana L.) merupakan sumber alami pigmen karotenoid utama biksin dan norbiksin yang memiliki potensi sebagai pewarna alami sekaligus antioksidan. Efisiensi perolehan senyawa tersebut sangat dipengaruhi oleh metode ekstraksi dan jenis pelarut yang digunakan. Penggunaan pelarut organik konvensional menimbulkan isu keamanan dan lingkungan, sehingga diperlukan pengembangan metode ekstraksi hijau. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode ekstraksi ramah lingkungan berbasis Natural Deep Eutectic Solvents (NaDES) yang dikombinasikan dengan Ultrasonic-Assisted Extraction (UAE) serta mengevaluasi aktivitas antioksidan ekstrak biji kesumba.Penelitian dilakukan secara eksperimental laboratorium dengan variasi jenis dan rasio molar komponen NaDES berbasis kolin klorida sebagai hydrogen bond acceptor dan asam laktat atau gliserin sebagai hydrogen bond donor. Ekstraksi dilakukan menggunakan UAE selama 60 menit. Total pigmen ditentukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis, sedangkan aktivitas antioksidan diuji dengan metode peredaman radikal DPPH untuk memperoleh nilai IC₅₀. Analisis data dilakukan menggunakan uji oneway ANOVA dengan tingkat signifikansi p < 0,05.Hasil penelitian menunjukkan bahwa variasi jenis dan rasio NaDES berpengaruh signifikan terhadap efisiensi ekstraksi dan aktivitas antioksidan. NaDES ChCl:AL (1:4) menghasilkan total pigmen tertinggi sebesar 21,41 ± 0,04% dan menunjukkan aktivitas antioksidan paling kuat dengan nilai IC₅₀ 2,68 mg/L, yang secara signifikan lebih baik dibandingkan kontrol positif vitamin C (IC₅₀ 5,86 ± 0,01 mg/L). Temuan ini menegaskan bahwa kombinasi NaDES–UAE merupakan metode ekstraksi hijau yang efektif dan berpotensi dikembangkan lebih lanjut.