Pemanfaatan tanaman daun sambung nyawa (Gynura procumbens) sebagai agen terapeutik terus meningkat, namun informasi mengenai toksisitas akutnya masih terbatas. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi toksisitas akut ekstrak etanolik daun sambung nyawa melalui uji in silico menggunakan ProTox 3.0 dan ECOSAR v2.2 serta uji in vivo pada embrio zebrafish menggunakan metode Fish Embryo Acute Toxicity (FET) berdasarkan OECD Test Guideline No. 236. Analisis in silico memprediksi toksisitas senyawa penyusun ekstrak, sedangkan uji in vivo dilakukan selama 96 jam dengan parameter mortalitas dan abnormalitas perkembangan embrio. Data mortalitas dianalisis menggunakan analisis probit untuk menentukan nilai LC₅₀-96 jam.Hasil in silico menunjukkan sebagian besar senyawa memiliki potensi toksisitas rendah hingga sedang, meskipun beberapa senyawa diprediksi memiliki toksisitas akuatik yang lebih tinggi. Uji in vivo menunjukkan peningkatan mortalitas dan abnormalitas embrio secara dose-dependent Nilai LC₅₀-96 jam yang diperoleh sebesar 368,787 ppm (95% CI: 326,726—408,658 ppm). Nilai NOAEL dan LOAEL masing-masing ditetapkan sebesar 150 ppm dan 300 ppm. Meskipun nilai LC₅₀ menunjukkan toksisitas akut yang rendah, berbagai abnormalitas perkembangan teramati pada konsentrasi di bawah LC₅₀, meliputi edema perikardium, edema yolk sac, cacat notokorda, edema ekor, kelainan bentuk tulang belakang, kelainan bentuk kepala atau mata, penyumbatan darah, serta hilang pigmentasi. Hasil ini menunjukkan bahwa nilai LC₅₀ hanya merepresentasikan efek letal dan belum menggambarkan risiko developmental toxicity. Dengan demikian, ekstrak etanolik daun sambung nyawa memiliki toksisitas akut rendah berdasarkan nilai LC₅₀-96 jam, namun berpotensi mengganggu perkembangan embrio pada konsentrasi yang lebih rendah dari LC₅₀. Oleh karena itu, penilaian keamanan ekstrak tidak dapat hanya didasarkan pada parameter letalitas.