Produksi benih kentang berkualitas tinggi di Indonesia masih terkendala oleh ketersediaannya yang terbatas. Salah satu teknik untuk menyediakan benih kentang yang unggul, seragam, dan bebas penyakit dalam jumlah besar adalah melalui kultur jaringan untuk induksi mikrotuber. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh penambahan paklobutrazol dan asam salisilat, serta kondisi lingkungan yang berbeda (gelap dan terang), terhadap pertumbuhan dan induksi mikrotuber pada varietas kentang Dayang Sumbi. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, pada bulan Juli hingga Desember 2025. Metode yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga faktor: faktor pertama adalah konsentrasi paklobutrazol (0; 0,5; 1; dan 1,5 ppm), faktor kedua adalah konsentrasi asam salisilat (0; 0,5; dan 1 ppm), dan faktor ketiga adalah kondisi lingkungan (gelap dan terang), dengan tujuh ulangan, dilanjutkan dengan uji Analisis Ragam (ANOVA) dan kemudian Uji Jarak Berganda Duncan (DMRT). Apabila hasil ANOVA menunjukkan pengaruh yang signifikan antarfaktor, dilanjutkan dengan uji regresi. Hasil penelitian menunjukkan adanya interaksi yang signifikan antara penambahan paklobutrazol, asam salisilat, dan kondisi lingkungan terhadap pertumbuhan dan perkembangan mikrotuber. Lingkungan gelap terbukti lebih responsif dan kondusif dalam mempercepat inisiasi serta meningkatkan jumlah dan bobot mikrotuber dibandingkan dengan lingkungan terang, yang cenderung merangsang pertumbuhan vegetatif. Paklobutrazol bekerja efektif sebagai penghambat biosintesis giberelin untuk menekan pertumbuhan vegetatif dan menginduksi pembentukan umbi, sedangkan asam salisilat berfungsi sebagai elisitor yang mendukung proses tersebut. Kombinasi paklobutrazol 0,5 ppm dan asam salisilat 1 ppm dalam lingkungan gelap menghasilkan produktivitas mikrotuber yang optimal, dengan peningkatan 6,5 kali lipat dibandingkan perlakuan kontrol.