Biofilm yang dibentuk oleh Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus merupakan salah satu faktor utama yang berkontribusi terhadap peningkatan resistensi bakteri terhadap terapi antimikroba. Daun tanaman Moringa oleifera L., diketahui mengandung senyawa flavonoid yang berpotensi sebagai agen antibiofilm alami. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi aktivitas antibiofilm ekstrak etanol 70% daun kelor terhadap P. aeruginosa dan S. aureus, serta menentukan kadar kuersetin sebagai senyawa penanda menggunakan metode KLT-densitometri.Ekstrak daun M. oleifera L. diperoleh menggunakan metode Ultrasound-Assisted Extraction (UAE) dalam pelarut etanol 70%. Aktivitas antibiofilm dievaluasi menggunakan metode microtiter plate assay dengan pewarnaan kristal violet berdasarkan waktu optimum pembentukan biofilm yang ditetapkan pada 72 jam. Uji penghambatan pembentukan biofilm dilakukan pada konsentrasi 0,133; 0,200; 0,267; dan 0,333 mg/mL, sedangkan uji degradasi biofilm dilakukan pada konsentrasi 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 mg/mL. Data aktivitas antibiofilm dianalisis menggunakan uji One-Way ANOVA pada taraf kepercayaan 95%. Penetapan kadar kuersetin dilakukan menggunakan KLT-densitometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun M. oleifera L. memiliki aktivitas antibiofilm terhadap P. aeruginosa dan S. aureus. Persentase penghambatan biofilm tertinggi diperoleh pada konsentrasi 0,333 mg/mL, yaitu sebesar 28,05% terhadap P. aeruginosa dan 33,19% terhadap S. aureus. Pada uji degradasi biofilm, persentase degradasi tertinggi diperoleh pada konsentrasi 1 mg/mL, yaitu sebesar 20,01% terhadap P. aeruginosa dan 27,15% terhadap S. aureus. Peningkatan konsentrasi ekstrak berpengaruh signifikan terhadap aktivitas antibiofilm (p<0,05). Analisis KLT menunjukkan bahwa nilai faktor retensi (Rf) ekstrak sebesar 0,58 sesuai dengan nilai Rf standar kuersetin. Analisis KLT-densitometri menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun M. oleifera mengandung kuersetin dengan kadar rata-rata sebesar 1,68 ± 0,76%.