Daun pegagan (Centella asiatica Urb.) merupakan bahan alam yang memiliki aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri dari daun pegagan didapatkan karena daun pegagan mengandung zat antibakteri yaitu flavonoid, saponin, tanin, fenol, terpenoid, dan steroid. Keefektifan aktivitas antibakteri daun pegagan dalam membunuh M. tuberculosis salah satunya disebabkan keberadaan asiatikosida yang termasuk dalam golongan terpenoid. Asiatikosida memiliki kelarutan yang rendah dalam air, sehingga dapat menghambat absopsi ke dalam darah yang menyebabkan rendahnya bioavailabilitas. Oleh karena itu, ekstrak daun pegagan diformulasikan menjadi nanoemulsi untuk meningkatkan penetrasi dan stabilitas dari kandungan daun pegagan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak daun pegagan dan surfaktan tween 80 terhadap karakterisasi nanoemulsi, serta menentukan formula optimum nanoemulsi dengan variabel yang dikaji menggunakan metode 2² factorial design. Daun pegagan diekstraksi dengan maserasi menggunakan etanol 70%. Formula optimum nanoemulsi ditentukan berdasarkan parameter ukuran partikel, indeks polidispersitas (PDI), entrapment efficiency (EE%), dan extract loading (EL). Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi ekstrak daun pegagan secara signifikan mampu meningkatkan extract loading, tetapi menurunkan ukuran partikel, indeks polidispersitas dan entrapment efficiency, sedangkan tween 80 berpengaruh terhadap peningkatan ukuran partikel, tetapi menurunkan indeks polidispersitas, entrapment efficiency dan extract loading. Formula optimum yang diperoleh berukuran 159,025±0,451 nm; PDI 0,289±0,008; EE 66,162±0,517%; dan EL 98,336±0,013 mg/g yang mengandung ekstrak daun pegagan sebesar 90% dan tween 80 sebesar 3%. Berdasarkan penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa nanoemulsi yang diperoleh mempengaruhi hasil karakterisasi parameter yang dikaji.