Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar sapi betina di sub-populasi sonok menggunakan analisis keragaman mtDNA serta mengamati persebaran sapi-sapi tersebut di pulau Madura. Sampel penelitian yang digunakan adalah 39 sampel darah sapi madura sonok yang diambil di Kecamatan Waru, Pasean, dan Batu Marmar Provinsi Jawa Timur. Metode yang dilakukan meliputi: koleksi sampel darah, ekstraksi DNA, Polymerase chain Reaction (PCR), elektroforesis, UV-Transiluminator, dan sequencing. Analisis data menggunakan aplikasi unipro Ugene v. 44.0, Mega 11.0.13, QGIS 3.32, DnaSP, dan Network. Hasil penelitian menunjukan bahwa dari 39 sampel yang digunakan hanya terdapat 27 sampel yang dapat dianalisis. Rekonstruksi pohon filogenetik menunjukan bahwa 27 sampel sapi madura sonok terbagi menjadi 2 kelompok besar. Kelompok tersebut kemudian terbagi menjadi 4 kelompok kecil yang tersebar pada wilayah Kecamatan Waru dan Pasean. Perhitungan keragaman genetik menunjukan bahwa nilai Fst sapi madura sonok pada populasi kecamatan waru dengan pasean bernilai 0,08211. Nilai tersebut menandakan bahwa tingkat keragaman genetik pada populasi tersebut menunjukan tingkat yang sedang. Hasil analisis keragaman haplotipe pada 27 sampel sapi madura sonok terbagi kedalam 15 haplotipe. Kesimpulan dari penelitian ini bahwa sapi madura sonok betina yang ada di Kecamatan Waru dan Pasean memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dan sudah tersebar merata di Kecamatan Waru dan Pasean.