Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kekerabatan dan pola penyebaran dari sapi madura sonok jantan pemacek. Sampel yang digunakan adalah 23 sampel darah sapi madura sonok jantan pemacek yang diambil di wilayah pengembangan sapi madura sonok terutama pada wilayah Kecamatan Waru, Batu Marmar, dan Pasean. Metode yang dilakukan meliputi: koleksi informasi sapi madura sonok, koleksi sampel darah, ekstraksi DNA, Polymerase chain Reaction (PCR), elektroforesis, UV- Transiluminator, dan sequencing. Analisis data menggunakan aplikasi unipro Ugene v. 44.0, Mega 11.0.13,QGIS 3.32, DnaSP, dan Network. Hasil penelitian menunjukan bahwa dari 23 sampel sapi pejantan madura sonok yang digunakan hanya 21 sampel sapi pejantan madura sonok yang dapat dianalisis. Sampel tersebut kemudian akan terbagi menjadi satu kelompok besar dan 3 kelompok kecil, dengan wilayah penyebaran sapi sonok jantan terpusat di Kecamatan Pasean. Perhitungan keragaman genetik menggunakan Fst memiliki nilai 0,0211. Hasil Analisa haplotipe untuk 21 sampel terbagi menjadi 5 haplotipe. Kesimpulan dari penelitian ini bahwa sapi pejantan madura sonok masih memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat dan dibutuhkan sumber pejantan baru untuk menghindari terjadinya inbreeding.