Indonesia memiliki 9?ri kekayaan spesies ikan air tawar yang ada di dunia. Ikan berperan penting dalam keberlangsungan ekosistem. Danau Ranu Pani, Ranu Regulo dan Ranu Darungan termasuk dalam kawasan TNBTS belum memiliki data ikan air tawar. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keanekaragaman jenis ikan yang ada di TNBTS berdasarkan pendekatan eDNA metabarcoding serta mengetahui hubungan kekerabatan ikan berdasarkan pohon filogenetik. Penelitian ini dilakukan dengan mengekstraksi DNA lingkungan dari sampel air sebanyak 1L pada 2 titik sampling ditiap-tiap danau. DNA yang terekstraksi kemudian diamplifikasi menggunakan primer MiFish dengan tambahan overhang. DNA Amplicon disekuensing hingga diperoleh data mentah sekuens. Sekuens yang didapat disejajarkan dengan Blast+ untuk diidentifikasi kemudian dianalisis keanekaragaman alfa dan beta menggunakan QIIME2, serta membuat pohon filogenetik dengan menggunakan software MEGA X. Hasil penelitian menunjukan sekuens DNA terdiri dari 81 ASV teridentifikasi sebagai 8 jenis spesies ikan dari 5 famili ditemukan di TNBTS. Jenis yang paling melimpah yaitu gambusia affinis pada danau Ranu Pani dan Ranu Regulo sedangkan Oreochromis niloticus dan Barbodes binotatus paling melimpah pada Ranu Darungan. Indeks keragaman alfa menggambarkan Ranu Pani memiliki indeks keragaman rendah sedangkan Ranu Regulo dan Ranu Darungan termasuk kategori sedang. Berdasarkan keragaman beta, Danau Ranu Pani dan Regulo cenderung memiliki komunitas ikan yang mirip dibandingkan dengan Ranu Darungan. Pengaruh lingkungan berupa suhu dan pH air memberikan dampak terhadap keberadaan ikan dan Ranu Pani merupakan danau yang memiliki faktor lingkungan kurang mendukung dengan pH air yang tinggi. Pohon filogenetik menunjukan kedekatan ikan dari famili Cichlidae dengan Osphronemidae dan berkerabat jauh dengan Poeciliidae. Keanekaragaman ikan dan hubungan filogenetik selanjutnya dapat digunakan sebagai acuan penentuan strategi konservasi, memantau perubahan lingkungan, mendukung pengelolaan keanekaragaman hayati, dan memandu pemanfaatan sumber daya secara berkelanjutan.