Kajian ini memiliki tujuan untuk mengetahui perbandingan kualitas kimia susu antara sapi perah Peranakan Friesian Holstein (PFH) yang terjangkit mastitis subklinis dan sapi dalam keadaan sehat. Penelitian ini dilaksanakan di Kampung Susu Lawu Singolangu, Kecamatan Plaosan, Kabupaten Magetan. Sampel susu diambil dari seluruh sapi laktasi yang tidak menunjukkan gejala maupun kondisi mastitis klinis. Penentuan sampel susu sapi terjangkit mastitis subklinis ditentukan berdasarkan uji California Mastitis Test (CMT). Analisis kualitas kimia susu menggunakan alat lactoscan milk analyzer tipe SAP (Merek Milkotronic Ltd). Data yang diperoleh diolah menggunakan uji t tidak berpasangan. Variabel yang diambil yaitu kadar lemak, kadar protein, kadar laktosa, berat jenis dan bahan kering tanpa lemak (BKTL). Hasil analisis pada parameter kadar lemak menunjukkan hasil signifikan (P<0>0,05). Hasil kadar lemak pada sapi terjangkit mastitis subklinis sebesar 4,20%. Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa kualitas kimia susu sapi terjangkit mastitis subklinis pada tingkatan ringan memiliki kadar lemak yang lebih rendah daripada sapi sehat sedangkan kadar protein, kadar laktosa, berat jenis dan bahan kering tanpa lemak memiliki kualitas yang sama.